环境工程学报, 12(10): 2917-2928

DOI 10.12030/j.cjee.201803022    中图分类号  X53   文献标识码  A


王宝山,温成成,孙秦川, 等. 石油烃类污染对青藏高原北麓河地区冻区土壤微生物多样性的影响[J]. 环境工程学报,2018,12(10):2917–2928.
WANG Baoshan, WEN Chengcheng, SUN Qinchuan, et al. Effects of petroleum hydrocarbon pollution on soil microbial diversity in permafrost region of Beiluhe area of Qinghai-Tibet plateau [J]. Chinese Journal of Environmental Engineering,2018,12(10):2917-2928.
石油烃类污染对青藏高原北麓河地区冻区土壤微生物多样性的影响
王 宝山 *, 温 成成, 孙 秦川 , 赵 峰德
兰州交通大学环境与市政工程学院,兰州 730070
第一作者:王宝山(1979-),男,博士,副教授,研究方向:水污染与环境污染控制。E-mail:loveleslie1024@163.com
*
通信作者
收稿日期: 2017-03-03; 录用日期: 2018-05-31
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(51368029);甘肃省重点研发计划(17YF1FA114)

摘  要 

为了探究石油烃类污染对青藏高原冻土区土壤微生物多样性及群落结构的影响,以柴油、机油为典型的石油烃类污染物,原位人工模拟污染,利用MiSeq高通量测序技术分析和比较了4 个土样在土壤微生物多样性及群落结构维度的差异性,并识别了具有石油烃类污染物降解功能的菌群。结果表明: 4 个土样中可变区的遗传物质,在97%的相似度水平下产生有效的OTU 944 个,获得土壤微生物群落25 门、56 纲、115 目、213 科、315 属。石油烃类污染可改变原有土壤微生物多样性及群落结构,4 个土样中细菌的多样性为机油污染土样(SLO) >上层5 cm处未污染土样(TS) >中层20 cm处未污染土样(MS) >柴油污染土样(SDO),SLO(机油污染土样)多样性最高,其次为未污染土样(TS、MS),SDO(柴油污染土样)多样性最低;未污染土样(TS、MS)在垂直方向群落结构差异较小,分布基本一致,SDO、SLO与未污染土样群落结构相比差异较大,SDO、SLO样本间差异同样明显;识别出具有石油烃类污染物降解功能的菌属包括Sulfuritalea属、红球菌属(Rhodococcus)、红游动菌属(Rhodoplanes)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、Alkanindiges属、诺卡氏菌属(Nocardioides)、放线菌属(Actinobacteria norank)等7 种。研究结果揭示了石油烃类污染对高寒冻土区土壤微生物多样性及群落结构的影响,在石油烃类污染物的胁迫作用下产生出具有石油烃类污染物降解功能的优势菌群,为该地区进行原位石油烃类污染修复提供技术支持。
Effects of petroleum hydrocarbon pollution on soil microbial diversity in permafrost region of Beiluhe area of Qinghai-Tibet plateau
WANG Baoshan *, WEN Chengcheng, SUN Qinchuan , ZHAO Fengde
School of Environmental and Municipal Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, China
*
Corresponding author

Abstract  

To explore the effect of petroleum hydrocarbon pollution on soil microbial diversity and community structure in permafrost region of Qinghai-Tibet plateau, oil and diesel pollutions were added to this areas in situ, and the MiSeq high-throughput sequencing was applied to analyze the difference of soil microbial diversity and community structure between the original samples and the petroleum hydrocarbon pollution samples as well as to identify the flora with degradation function of petroleum hydrocarbon pollutants. The results showed that total 944 OTU bands were obtained from the four soil samples under the level of similarity of 97% genes of variable regions based on high-throughput sequencing. Bacterial species detected in those samples covered 25 phyla, 56 classes, 115 orders, 213 families, 315 genera. The original soil microbial diversity and community structure were changed obviously by an addition of petroleum hydrocarbon. The bacterial diversity of four soil samples was in order of oil-contaminated soil samples (SLO)> uncontaminated soil samples at the top of 5 cm (TS)> uncontaminated soil samples in the middle of 20 cm (MS)> diesel-contaminated soil samples (SDO), indicating that SLO diversity was highest, and the lowest diversity of four soil samples was SDO. The difference of community structure in the vertical direction of TS and MS was negligible. By comparison, the difference of community structure was significant between SDO, SLO and uncontaminated soil samples. There were over 7 genera identified with the potential of the degradation function of petroleum hydrocarbon pollutants, including Sulfuritalea, Rhodococcus, Rhodoplanes, Sphingomonas, Alkanindiges, Nocardioides and Actinobacteria norank. The results of the study revealed the effect of petroleum hydrocarbon pollutions on soil microbial diversity and community structure in the permafrost region, found the dominant bacteria with the degradation function of petroleum hydrocarbon pollutants under the environmental stress of petroleum hydrocarbon pollutants, which can provide technical support for in-situ bioremediation of petroleum pollution in the permafrost region.
石油作为推动社会发展的主要能源物质,伴随着其开采、运输、冶炼及消费等环节所引发的土壤环境污染问题日益突出[1-2]。石油类污染物进入土壤后会造成土壤中的微生物多样性降低和微生物群落结构发生改变,打破原有的土壤生态平衡;石油类衍生物(如苯系物和多环芳香烃等“三致性”物质)进入土壤后,可迁移扩散污染周围水体,对人类生存健康形成潜在的危害[3-4]。中俄原油管道与格拉成品油输送管道均穿越多年冻土区和季节性冻土区,由于冻土区的季节性冻融作用已导致发生30多次石油泄漏事件[5],所以,对于多年冻土区石油类污染物对土壤微生物多样性和微生物群落结构影响及石油类污染治理方法已成为众多学者的研究方向。
素有“世界脊梁”之称的青藏高原,高寒缺氧,其土壤常年处于低温、缺氧、寡营养等极端严酷条件下[6],生态环境脆弱,冻土区石油污染土壤修复不宜采用物理和化学方法。生物方法因修复成本低、二次污染小、环境扰动少且生态风险低而逐渐成为石油污染土壤治理的重要选择[7]。然而,传统的生物平板培养方法仅能分离出土壤微生物总数的0.11% ~0.1%,高通量测序分析技术的运用,克服了传统生物平板培养方法的瓶颈[8],可以较全面准确地反映土壤中微生物生存状态和群落结构信息[9],提高了石油污染土壤微生物修复机理认识。杨蕊琪等[10]应用高通量技术对祁连山地区低温原油降解菌群研究发现,变形菌门和放线菌门是青藏高原原生态土壤中的优势菌门,且土壤污染后变形菌门和放线菌门将及时对环境变化作出响应,同时菌种数量变化与海拔相关;杨智等[11]在玉门石油污染土壤中分离出37株细菌,其中红球菌属、假单胞菌为优势菌属,且菌株的降解效果明显,Rhodococcus sp.YM43降解率为55.47%,Rhodococcus sp.YM09降解率为38.85%,Pseudomonas sp.YM15降解率为33.84%;PANICKER等[12]对南极原油污染土壤细菌进行了分离,其中放线菌门、变形菌门、假单胞菌属均为优势菌属,且假单胞菌属所占比例50%。
土壤中微生物的种类可达数万种,这些土壤微生物对生物圈各类有机物、无机金属离子等物质的分解与转化过程起着重要的作用[13]。冻土区气候条件极端,外来石油降解微生物难以适应青藏高原特殊的区域特征,且可能对生态环境造成不可逆转的破坏,掌握土壤微生物群落结构和多样性信息有利于筛选出高效的土著石油降解微生物。目前,对于青藏高原冻土区石油污染土壤中微生物方向的研究还十分缺乏,无法构建完整的石油污染土壤微生物修复体系。本研究以柴油、机油为典型代表污染物,通过现场石油人工模拟污染实验,借助微生物高通量测序技术,研究不同石油类污染物下土壤微生物结构特征,识别土壤中石油降解微生物功能菌群,揭示土壤石油污染与微生物多样性的关系,为该地区土壤石油污染物修复提供技术支持。

1 实验部分

1.1 土壤采集与处理

实验土壤来自青藏高原北麓河地区,东经92°55′45″、北纬34°49′26″,海拔4 644 m,地势比较平坦稍起伏,属于青藏高原亚寒带半干旱气候,年平均气温为−3.8 ℃,冻土类型主要以富冰和多冰冻土为主,局部有含土冰层存在[14-16]。为了研究石油烃类污染对青藏高原冻土区土壤微生物多样性的影响且提高低温石油土著降解菌的筛选效率,以柴油和机油作为典型的石油烃类污染物,分别对青藏高原北麓河地区的2 处土壤进行了人工模拟污染,并对污染区域进行标识。污染区域单块面积为0.4 m2,污染深度为10 cm,污染强度为1 kg·m−2。2015年6月完成了实验现场的构建及土壤石油烃类污染模拟工作,2017年10月对实验区域的土样进行采集,污染周期为16 个月,共获得4 个土壤样品。分别代表不同性质的石油烃类污染条件包括柴油污染土样(SDO)、机油污染土样(SLO)、上层5 cm处未污染土样(TS)以及中层20 cm处未污染土样(MS)。
采集的土样置于装有冰袋的恒温箱,立即带回兰州实验室4 ℃保存[17]。参考杨茜等[18]处理土壤样品的方法,在无菌条件下,对4 个土样(SDO、SLO、TS、MS)进行草根的去除和筛分,将处理后的土样低温保存进行后续土壤微生物高通量测序分析。

1.2 土壤理化性质分析

对青藏高原北麓河地区实验点的土壤进行多点随机取样,取样深度为0 ~20 cm,重复3 次。样品采集后,按照标准方法对土壤理化性质进行分析,其中土壤的容重采用环刀法测定;有机质采用重铬酸钾容量法测定;总氮采用凯式法测定;总磷采用碱熔-钼锑抗比色法测定;土壤pH采用酸度计(PT-10,Sartorius)测定(土水比1:5)。土壤基本理化性质见表1
表1 土壤基本理化性质
Table 1 Basic physical and chemical characteristic of soil
表1 土壤基本理化性质
Table 1 Basic physical and chemical characteristic of soil
容重/(g·cm−3
有机质/%
总氮/(g·kg−1
总磷/(g·kg−1
pH
1.02±0.12
8.57±0.41
6.21±0.53
3.84±0.21
6.29±0.23

1.3 基因组DNA提取及质量检测

土样中微生物基因组DNA采用Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒进行提取,之后对提取的基因组DNA进行浓度、纯度检测及完整性检测。采用超微量紫外分光光度计进行基因组DNA检测,并用OD260/OD280和OD260/OD230比值比较样品纯度。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测对抽提的基因组DNA实施完整性检测。

1.4 PCR扩增

以土样中提取的微生物基因组DNA为模板,对微生物16S rRNA基因V3+V4进行扩增。细菌16S rRNA引物名称为338F-806R(338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。PCR扩增产物经建库检测,将合格的文库在Illumina MiSeq 平台[19]进行高通量测序(细菌测序平台:PE300平台)。

1.5 高通量测序及数据分析

为了得到准确且高质量的基因序列信息,保证后续分析结果的准确性,首先利用Trimmomatic软件对原始序列进行拼接,同时对拼接好的序列进行质控过滤,质控过滤控制参数为Q20,数据过滤去除的标准:去除含有N(模糊碱基)的序列;去除尾部质量值≤20的碱基;去除长度≤400 bp的序列,然后运用Mothor软件去除嵌合体序列,最终得到有效序列数据。
采用Uclust方法在97%下对有效序列进行OTU(操作分类单元)聚类,在聚类过程中去除嵌合体,得到OTU的代表序列。将所有优化序列与OTU代表序列比对,选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列,生成OTU表格。
首先在基因组DNA检测的基础上,通过OD260/OD280和OD260/OD230比值校核样品纯度;然后对有效序列进行数据优化与统计、OTU分布统计,以稀释性曲线来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度,并说明样本的测序数据量合理性;最后计算样品中物种丰富度指数Chao和ACE、多样性指数Shannon和Simpson[20],绘制Venn图(维恩图)、PCoA分析(主坐标分析)图、样本相似度树状与群落结构柱状图及样本群落结构组成分布。通过对样品进行Alpha多样性分析、Beta多样性分析和系统发育树的构建,实现样本群落多样性分析和群落结构分析,识别石油降解微生物优势菌群。

2 结果与分析

2.1 高通量测序及质量控制结果

采用Illumina MiSeq 2000 平台(由上海美吉生物医药科技有限公司提供)对4 个土样(SDO、SLO、TS、MS)进行高通量测序。表2为样品DNA质量检测结果,样品DNA浓度为21.3 ~28.7 ng·μL−1,OD260/OD280接近1.8且OD260/OD230小于2,说明提取的DNA含有极少量杂质,总体DNA纯度较高,可以进行后续实验。
表2 样品DNA质检结果
Table 2 Result of quailty inspection of DNA
表2 样品DNA质检结果
Table 2 Result of quailty inspection of DNA
序号
样品名称
浓度/(ng·μL−1)
OD260/OD280
OD260/OD230
1
SDO
28.7
1.72
0.14
2
SLO
27.1
1.66
0.91
3
TS
24.3
1.67
1.00
4
MS
21.3
1.77
0.05
利用高通量测序技术,经过序列优化处理和样品序列统计,4 个土样共产生170 493 个序列,序列平均长度为438 bp。表3为有效序列的长度分布,序列平均长度在441 ~460 bp和421 ~440 bp,占比较大,分别为51.68%、48.05%,用于后续分析的优质序列占总体序列总数的99.73%,实验序列数据能够较全面地反映样本总体信息。
表3 有效序列长度分布
Table 3 Length distribution of trimed sequences
表3 有效序列长度分布
Table 3 Length distribution of trimed sequences
序列长度/bp
序列数/个
百分比/%
序列长度/bp
序列数/个
百分比/%
281~360
2
0
421~440
81 919
48.05
361~380
1
0
441~460
88 114
51.68
381~400
8
0
461~480
395
0.23
401~420
50
0.03
481~540
3
0
采用mothur做rarefaction分析,在97%的相似度水平下对OTU进行生物信息统计,从样本中随机抽取一定数量的个体,并以个体数与物种数构建稀释性曲线(图1)。通过图1可以得出,4 个土样的稀释性曲线在97%的相似度水平下趋于平坦,说明测序数据合理,更多的数据量只会产生少量新的OTU,测序深度符合实验预期,基本能够反映冻土区微生物群落结构和多样性信息。
图1 OTU稀释曲线
Fig. 1 Rarefaction curves of OTU
图1 OTU稀释曲线
Fig. 1 Rarefaction curves of OTU
Cjee 201803022 t1

2.2 微生物群落多样性分析

土壤微生物群落与其他环境生物群落相比,有更高的物种丰富度和更复杂的微生物群落基因组成[21]
利用软件对序列进行优化,去除嵌合体,在97%相似性水平进行非重复序列的OTU聚类,得到OTU的代表序列。对得到的OUT的代表序列进行分类学分析,与数据库对比,形成各样本OTU聚类信息统计结果(见表4)。
表4 土壤中微生物组成及多样性分析
Table 4 Analysis of composition and biodiversity of microbiology in soil
表4 土壤中微生物组成及多样性分析
Table 4 Analysis of composition and biodiversity of microbiology in soil
样品
序列数/个
覆盖率/%
OTU数量/个
Ace
指数
Chao指数
Shannon指数
Simpson指数
SDO
27 174
99.65
742
799
810
4.93
0.046 3
22
51
106
191
272
SLO
29 717
99.82
807
830
833
5.83
0.005 6
23
52
108
199
292
TS
29 414
99.82
778
802
808
5.66
0.008 1
24
53
106
190
271
MS
28 783
99.81
774
802
813
5.66
0.008 1
25
52
107
196
275
OTU分布维恩图可以直观地表现样本中OTU数目组成相似性及重叠情况。利用R语言工具统计4个样品(SDO、SLO、TS、MS)中所共有和独有的OTU数目,并绘制OTU分布维恩图(见图2)。
图2 OTU分布维恩图
Fig. 2 Venn graphs of OTU
图2 OTU分布维恩图
Fig. 2 Venn graphs of OTU
Cjee 201803022 t2
表4可知,4 个土样(SDO、SLO、TS、MS)的覆盖率在99.65% ~99.82%之间,呈现较高的覆盖率,数据能够反映样本微生物容量的总体情况。由图2可知,4 个土样(SDO、SLO、TS、MS)共产生944 个OTU,共同含有536 个OTU。SDO、SLO、TS、MS 等4 个样品中包含的OTU数目分别为742、807、778、774,独有的OTU数量为12、24、1、3。OTU数量SLO >TS≈MS >SDO,SLO(机油污染土样)OTU数量最多,SDO(柴油污染土样)OTU数量最少,TS(表层未污染土样)和MS(中层未污染土样)中OTU数量基本一致,表示石油烃类污染物对土壤中微生物多样性有所改变,但并非简单地增加或减少;未污染土样在垂直方向上微生物种类基本无变化。SDO和SLO独有的OTU数目较多,表示含有较多特有的微生物种类。
在97%的相似度水平下,计算Chao指数、ACE指数、Shannon指数、Simpson指数。其中前3个指标数值越大,最后一个指标数值越小,说明样品中物种越丰富。由表4可知,前3个指标大小顺序为SLO >TS >MS >SDO,表明SLO(机油污染土样)多样性最高,其次为未污染土样(TS、MS),SDO(柴油污染土样)多样性最低。同时,Simpson指数也印证了上述结论。

2.3 微生物群落结构分析

土壤微生物PCoA分析(主坐标分析)见图3。PCoA分析是一种非约束性的数据降维分析方法,可用来研究样本群落组成的相似性或差异性。TS和MS在图3中位置基本重合,PC1和PC2这个因素对SDO样本均作用相当,而SLO的主影响因素为PC1。研究结果表明,未污染土样(TS、MS)微生物群落差异较小,而SDO、SLO土样由于柴油、机油的加入,相较于TS、MS样本,呈现一定的差异性,且SDO、SLO样本间差异同样明显,证明不同石油烃类污染物的加入对青藏高原冻土区的微生物多样性有重要影响。石油烃类(柴油、机油)污染物的加入,可以改变青藏高原冻土区中土壤微生物原有的群落结构。
图3 土壤微生物PCoA分析
Fig. 3 Principal co-ordinates analysis of microbiology in soil
图3 土壤微生物PCoA分析
Fig. 3 Principal co-ordinates analysis of microbiology in soil
Cjee 201803022 t3
图4(a)为样本相似度树状图(即样本中微生物系统发育图),图4(b)为群落结构柱状图。
本研究共获得土壤微生物群落25 门,其中SDO含22 门、SLO含23 门、TS含24 门、MS含25门。相较于MS,TS缺少衣原体门(Chlamydiae);SDO缺少了3 门,其中1 门为迷踪菌门(Elusimicrobia)和其余2 门为未分类门(Candidate division);SLO缺少了2 门,均为未分类门(Candidate division)。
在门水平分类上,以NCBI Taxonomy生物学门类数据库为基础,识别了土壤样品中相对丰度较高的门水平微生物,主要包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、Saccharibacteria门、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae),共9 个门。在图4(b)样本群落结构柱状图中,相较于未污染土样(MS、TS样品),由于石油烃类污染物的加入,使得SDO、SLO样品中5 个门类微生物明显减少,包括酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae);SDO样品中变形菌门(Proteobacteria)、Saccharibacteria门相对丰度增加明显,SLO样品中Saccharibacteria门、拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度有所增加,但SDO样品中拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度表现出与SLO样品不同的响应,即有所减少。
图4(a)所示,以微生物系统发育角度分析,样本微生物在系统发育上共分为3 个主要的类群,即群Ⅰ(MS、TS为一个类群)、群Ⅱ(SDO)、群Ⅲ(SLO)。样本之间的差异性越小,在相似度树状图中便会处于相似的分支中,群Ⅰ中MS、TS样本均来自于青藏高原北麓河地区未污染土样,其样本之间的差异性较小,各门水平微生物相对丰度基本相似;群Ⅱ、群Ⅲ来源分别为柴油、机油污染土样,由于不同种类石油类污染物的加入,促使土著微生物以不同碳源发展出差异的优势菌群,造成原有土壤微生物结构发生变化。
图4 门水平下的样本聚类树与群落结构柱状图
Fig. 4 Community barplot and cluster tree of samples at phylum level
图4 门水平下的样本聚类树与群落结构柱状图
Fig. 4 Community barplot and cluster tree of samples at phylum level
Cjee 201803022 t4
通过分析可知,样本微生物分为3 个主要的类群,即群Ⅰ(MS、TS为一个类群)、群Ⅱ(SDO)、群Ⅲ(SLO)。样本相似度树状图与群落结构柱状图分析互为支持,从微生物系统发育和微生物相对丰度2 个角度阐释了未污染土样、柴油污染土样以及机油污染土样中微生物的群落结构变化,不同的碳源条件下,可以发展出不同的优势菌群。未污染土样(MS、TS)微生物在垂直方向群落较为相似,差异较小,SDO、SLO土样菌群差异性较大。石油烃类污染物的加入,改变了原有土壤中微生物群落结构,使得土壤原有微生物门类有所减少,迷踪菌门(Elusimicrobia)和未分类门消失;部分微生物相对丰度发生改变,相较于未污染土样(MS、TS),SDO、SLO土样中Saccharibacteria门含量均增加明显,SLO土样中拟杆菌门(Bacteroidetes)含量有所增加,表明添加石油烃类污染物有利于Saccharibacteria门菌落的生长,柴油烃类物质对拟杆菌门菌群生长亦具有促进作用。

2.4 石油降解微生物优势菌群识别与分析

微生物对不同的碳源呈现不一致的响应规律,并在不同的碳源条件下驯化出适宜的优势菌群。以属为单元分析4 个(3 个主要的类群:群Ⅰ、群Ⅱ、群Ⅲ)土壤样品微生物群落,结果如图5所示。4 个土样中共提取到了315 个属,其中相对丰度大于1%的共45 个属,其中包括未知属24 个。
图5所示,未污染土样中TS、MS中优势菌群含量较为一致,石油烃类污染土样SDO、SLO中优势菌群组间差异较大,不同的石油烃类污染物(机油、柴油)条件下诱导出差异较大的优势菌群。SDO土样中优势菌群(相对丰度大于1%)共18 个属,分别为Sulfuritalea属(20.33%)、Saccharibacteria norank(9.76%)、Sphingobium属(2.80%)、分支杆菌(Mycobacterium、2.42%)、Parcubacteria norank(2.24%)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas、2.15%)、蛭弧菌属(Bdellovibrio、2.12%)、柄细菌属(Caulobacter、2.11%)、Alkanindiges(2.01%)、Subgroup 6 norank(2.00%)、气微菌属(Aeromicrobium、1.73%)、RB41 norank(1.67%)、Aquabacterium属(1.31%)、黄质菌属(Flavobacterium、1.28%)、WW2-159 norank(1.23%)、红球菌属(Rhodococcus、1.21%)、Phenylobacterium属(1.21%)及Corynebacteriales unclassified(1.02%);SLO土样中优势菌群(相对丰度大于1%)共18 个属,分别为Saccharibacteria norank(7.31%)、红球菌属(Rhodococcus、4.77%)、env.OPS 17 norank(4.22%)、Subgroup 6 norank(2.57%)、Alkanindiges属(2.43%)、Nevskiaceae norank(2.15%)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas、2.10%)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonadaceae uncultured、2.01%)、黄质菌属(Flavobacterium、1.97%)、Cytophagaceae uncultured(1.93%)、Ferruginibacter属(1.35%)、柄细菌属(Caulobacter、1.31%)、 短根瘤菌属(Bradyrhizobium、1.27%)、Hirschia属(1.21%)、RB41 norank(1.20%)、WW2-159 norank(1.16%)、芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae uncultured、1.03%)及Parcubacteria norank(1.03%)。
图5 属水平下的样本群落结构组成分布
Fig. 5 Bacterial community structure and distribution of samples at genus level
图5 属水平下的样本群落结构组成分布
Fig. 5 Bacterial community structure and distribution of samples at genus level
Cjee 201803022 t5
对属水平下4 个土样中SDO、SLO样品中占比较高的菌属进行功能性分析,同时列出未污染土样(TS、MS)中各石油烃类污染土样(SDO、SLO)中优势菌属的占比情况,结果如表5所示。目前,已发现石油烃类降解微生物约有100 余属、200 多种,涵盖细菌、放线菌、霉菌、酵母和藻类等,细菌在降解过程中起主导作用[22]。根据研究[23-30],石油烃类污染土样中,共有7 个属具有石油烃类污染物降解功能,其中红球菌属(Rhodococcus)、诺卡氏菌属(Nocardioides)可产表面活性剂,降低石油烃类污染物表面张力,实现其乳化和增溶,红游动菌属可降解苯丙烯酸和苯甲酸,Sulfuritalea属可实现石油烃类厌氧降解。此外,鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、Alkanindiges属、放线菌属(Actinobacteria norank)也能进行石油烃类污染物降解。
表5 土样中占比较高优势菌群功能性分析
Table 5 Functional analysis of dominant bacteria in samples of soil
表5 土样中占比较高优势菌群功能性分析
Table 5 Functional analysis of dominant bacteria in samples of soil
菌属
菌属名称
主要功能
所占比例/%
MS
SDO
SLO
TS
Sulfuritalea
石油烃类厌氧降解[23]
0
20.33
0
0.01
Rhodococcus
红球菌属
产表面活性剂,石油烃类好氧降解[24-25]
0.18
1.21
4.77
0.09
Rhodoplanes
红游动菌属
参与降解苯丙烯酸和苯甲酸光合的细菌[26]
2.59
0.41
0.41
2.35
Sphingomonas
鞘脂单胞菌属
石油烃类好氧降解[27]
0.82
2.15
2.10
0.54
Alkanindiges
石油烃降解[28]
0.02
2.01
2.43
0.06
Nocardioides
诺卡氏菌属
产表面活性剂,参与生物脱硫,石油烃降解[29]
1.22
0.93
0.76
0.39
Actinobacteria norank
放线菌属
石油烃降解[30]
1.34
0.26
0.26
1.39

3 讨论

3.1 石油烃类污染对青藏高原冻土区土壤微生物群落多样性的影响

微生物对不同碳源的利用可以反映微生物的代谢功能类群,石油烃类污染不但会影响土壤微生物活性,也促使微生物代谢变异,从而对碳源的利用发生选择性转移,改变冻土区土壤微生物群落多样性[31]。多样性的高低可以衡量土壤环境中微生物群落对不同碳源利用程度及抵抗外界扰动的能力[32-33]。石油烃类物质的加入,改变了原有土壤中的碳源结构,一定程度上影响了冻土区土壤中微生物群落的稳定性与功能性。
对4 个土样OTU数量统计及多样性指数分析结果表明,石油烃类(柴油、机油)污染物对原有土壤微生物多样性有所改变,其多样性改变结果与石油烃类污染物的种类有关,柴油污染可使原有土壤微生物多样性升高,而机油污染则相反;未污染土样(TS、MS)中TS(上层5 cm处未污染土样)的多样性略高,但土壤微生物在纵向上分布差异较小,基本一致。究其原因主要为碳源及环境条件的不同所致[34],特定的微生物只能实现有限的烃类降解,机油较柴油烃类含量及种类复杂,可诱导产生较多的稀有种,SDO、SLO土样中独有的OTU数量也对此有所印证;TS、MS中土壤环境温度对不同气候变化响应机制不同,表层土壤易受气候条件扰动,环境温度与冻土微生物存在一定的关联机制,呈现不同的微生物群落多样性,但这种关联机制较弱[35]。王金成等[36]对土壤微生物群落多样性与环境因子相关性的研究表明,石油烃类物质及环境因子(土壤温度、pH、TP、TN等)对土壤微生物群落多样性的影响属协同作用机制,但石油烃类物质为主导影响因子。研究表明,不同的碳源及环境条件可诱导产生特定的功能菌群,造成土壤微生物群落多样性的差异,但不同的石油烃类物质对冻土区土壤微生物群落多样性的影响并非简单的均一化,使其常见物种减少,这与石油烃类物质种类、污染周期及污染程度有关[37]

3.2 石油烃类污染对青藏高原冻土区土壤微生物群落结构的影响

土壤微生物群落结构不仅受到生物因素的调控,也与非生物因素(环境因素中碳源的改变)的影响密不可分[11]。石油烃类物质进入土壤后对生态环境的影响首先表现为土壤微生物群落结构组成、数量的改变,不同种类石油烃类污染条件下,可胁迫发展出差异较大的土壤微生物群落结构[3,38-39]
SUTTON等[40]研究表明,长期受柴油污染的土壤中,土壤群落结构发生了改变,土壤中主要的优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)。杨蕊琪等[10]研究表明,变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)是青藏高原原生态土壤中的优势菌门,该区域受到污染后变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)细菌会更快对变化的环境做出响应。上述结果基本与本研究结果一致,但有所差异,石油烃类物质进入土壤后,酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)明显减少,然而,SDO样品中变形菌门(Proteobacteria)有所增加,SLO样品中拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度提高。值得深入研究的是,SDO、SLO样品中,Saccharibacteria门因柴油、机油的加入,相对丰度均有所增加。孔令姣[41]研究发现,石油污染土壤强化修复前后,Saccharibacteria门含量明显增加,说明石油污染可导致土壤微生物群落结构动态变化。本研究结果显示,SDO、SLO样本中微生物群落组成呈现显著差异,说明引起群落结构差异的诱因主要是碳源的不同所致[42],而未污染土样(TS、MS)中土壤环境条件有所差异,但因碳源基本相同,所以生物群落组成相似,差异较小,即微生物在垂直方向群落分布基本一致。微生物系统发育角度分析与土壤微生物PCoA分析结果相互支持,即4 个土样共分为3 个主要的类群,即群Ⅰ(MS、TS为一个类群)、群Ⅱ(SDO)、群Ⅲ(SLO)。

3.3 石油烃类污染土壤中优势菌群及功能菌群分析

土壤中微生物是陆地生态系统的重要组成部分,对土壤中有机质的分解与转化起着重要作用[31]。由土壤环境温度组成的非生物学特性和土壤微生物群落构成的生物学特性均会导致微生物菌落结构的差异性,不同的碳源呈现差异的微生物多样性及群落结构响应[43]。以石油为唯一碳源的土壤环境中,土壤微生物在石油烃类物质的胁迫作用下,具有石油降解功能的微生物成为优势菌属,强化了对土壤微生物种群的选择,从而污染土壤中呈现独特的群落结构及特点[44]
国内外学者通过添加不同底物对石油降解微生物进行分离和驯化,目前已发现具有降解石油能力的微生物有100 属200 余种,已有报道中石油烃类降解微生物中起主导作用的为细菌,此外,放线菌属、诺卡氏菌属等放线菌也可降解石油烃[33]。 SAMPAIO等[23]从乔治王岛分离出一株石油降解菌,可实现厌氧生物降解石油烃类物质,经鉴定为Sulfuritalea属。杨智等[11]从西部荒漠地区石油污染土壤中分离出3 株石油降解菌KB1、2182和JC3-47,在含油培养基中培养3 d后,降解率分别为41.02%、32.26%和55.90%,3株菌均属于红球菌属(Rhodococcus)。CHANG等[28]通过中试实验评估了老化石油污染土壤中生物降解性能,6 ℃恒定平均温度下经过60 d,总石油碳氢化合物(TPH)的减少量为55%,其中混合菌液中主要的微生物为诺卡氏菌属(Nocardia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)等。上述结果表明,通过石油烃类污染可强化土壤微生物种群的选择,产生具有石油烃类降解的功能菌群,这与本研究结果(表5)基本一致,同时部分菌群具备可培养性。因此,通过高通量分析及已有研究的报道,可准确识别污染土样中功能菌群及其丰度,此研究为实验室石油降解菌群的筛选、分离及驯化提供了研究基础。

4 结论

1)采用Illumina Miseq 2000 平台对4 个土样(SDO、SLO、TS、MS)进行高通量测序。在97%相似性水平进行非重复序列的OTU聚类,共产生944 个OTU,获得土壤微生物群落25 门、56 纲、115 目、213 科、315 属。多样性分析结果显示4 个土样的细菌的多样性高低为SLO >TS >MS >SDO,SLO(机油污染土样)多样性最高,其次为未污染土样(TS、MS),SDO(柴油污染土样)多样性最低。
2)PCoA分析与系统发育角度分析结果显示,土壤微生物在垂直方向群落分布基本一致,石油烃类污染物的加入,使得原有土壤微生物群落结构发生改变,同时,不同种类石油烃类(柴油、机油)组间微生物群落结构同样差异明显。4 个土样可分为3 个主要的类群,即群Ⅰ(MS、TS为一个类群)、群Ⅱ(SDO)、群Ⅲ(SLO)。与未污染土样(TS、MS样品)相比较,SDO、SLO土样中Saccharibacteria门和SLO土样中拟杆菌门(Bacteroidetes)含量有所增加。添加石油烃类污染物有利于Saccharibacteria门菌落的生长,柴油烃类物质对拟杆菌门(Bacteroidetes)群生长亦具有促进作用。
3)本研究4 个土样获得相对丰度大于1%的共45 个属,其中SDO、SLO土样中优势菌群(相对丰度大于1%)各占18 个属。识别出具有石油烃类污染物降解功能的菌属等7 种,包括Sulfuritalea属、红球菌属(Rhodococcus)、红游动菌属(Rhodoplanes)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、Alkanindiges属、诺卡氏菌属(Nocardioides)、放线菌属(Actinobacteria norank)。在不同种类石油烃类污染物的胁迫作用下,石油烃类模拟污染土壤区域具备了筛选石油烃类降解功能的优势菌群的条件,且多数已识别石油降解优势菌具有可培养性。

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