en
×

分享给微信好友或者朋友圈

使用微信“扫一扫”功能。
参考文献 1
LEEJ, MINK R, KIMY. Cloning and overexpression of methylcatechol-2, 3-dioxygenase gene from toluene-degrading Pseudomonas putida, mt-2 (pWWO)[J]. Archives of Pharmacal Research, 1992, 15(4): 360-364.
参考文献 2
张杰, 刘永生, 冯家勋, 等. 邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因克隆、定位和高效表达[J]. 应用与环境生物学报, 2003, 9(5):542-545.
参考文献 3
胡日查, 孙立波. 低温-1,2,4-TCB降解菌的选育、降解特性及邻苯二酚-1,2-双加氧酶基因表达水平[J]. 环境工程学报, 2013, 7 (2): 777-782.
参考文献 4
BALDERAS-HERNANDEZV E, TREVINO-QUINTANILLAL G, HERNANDEZ-CHAVEZG, et al. Catechol biosynthesis from glucose in Escherichia coli anthranilate-overproducer strains by heterologous expression of anthranilate-1,2-dioxygenase from Pseudomonas aeruginosa PAO1[J]. Microbial Cell Factories, 2014, 13(1): 1-11.
参考文献 5
ARAUJOS S, NEVESC M, GUIMARAESS L, et al. Structural and kinetic characterization of recombinant 2-hydroxymuconate semialdehyde dehydrogenase from Pseudomonas putida G7[J]. Archives of Biochemistry & Biophysics, 2015, 579(1):8-17.
参考文献 6
LINJ, MILASER N. Purification and characterization of catechol-1,2-dioxygenase from Acinetobacter sp. Y64 strain and Escherichia coli transformants[J]. Protein Journal, 2015, 34(6): 1-13.
参考文献 7
LEEN, KWOND Y.Characteristics of a recombinant-2,3-dihydroxybiphenyl-1,2-dioxygenase from Comamonas sp. expressed in Escherichia coli[J]. Indian Journal of Microbiology, 2016, 56(4): 1-9.
参考文献 8
杜宏伟, 武俊, 肖琳, 等. 聚磷激酶基因在假单胞菌中的整合和表达[J]. 环境科学, 2009, 30(10): 3011-3015.
参考文献 9
蔡丰聚, 徐英黔. 基因工程菌稳定性的若干影响因素[J]. 生命的化学, 2006, 26(5): 451-453.
参考文献 10
NAGAYAMAH, SUGAWARAT, ENDOR, et al. Isolation of oxygenase genes for indigo-forming activity from an artificially polluted soil metagenome by functional screening using Pseudomonas putida strains as hosts[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(10): 4453-4470.
参考文献 11
陈志丹, 晁群芳, 杨滨银, 等. 一株芘降解菌B2的降解条件优化及降解基因[J]. 环境工程学报, 2012, 6(10): 3795-3800.
参考文献 12
谢云. 高效石油烷烃降解菌及原油降解基因工程菌构建研究[D]. 西安: 西北大学, 2014.
参考文献 13
聂麦茜, 张志杰, 雷萍. 优势短杆菌对多环芳烃的降解性能[J]. 环境科学, 2001, 22(6): 83-85.
参考文献 14
杨轩, 张威, 李师翁, 等. 多环芳烃降解菌的分离鉴定及其生理特性研究[J]. 环境科学学报, 2012, 32(5): 1033-1040.
参考文献 15
卫昆, 陈烁娜, 尹华, 等. 蜡状芽胞杆菌对芘的降解特性及降解酶研究[J]. 环境科学学报, 2016, 36(2): 506-512.
参考文献 16
胡凤钗, 苏振成, 孙健, 等. 高效芘降解菌N12的分离鉴定与降解特性[J]. 应用生态学报, 2011, 22(6):1566-1572.
参考文献 17
HUF C, LIX Y, SUZ C, et al. Identification and degradation capability of three pyrene-degrading Gordonia sp.strains [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2011, 22(7): 1857-1862.
参考文献 18
AL-THUKAIRA A, MALIKK. Pyrene metabolism by the novel bacterial strains Burkholderia fungorum (T3A13001) and Caulobacter sp (T2A12002) isolated from an oil-polluted site in the Arabian Gulf[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2016, 110: 32-37.
参考文献 19
JINJ, YAOJ, ZHANGQ, et al. Biodegradation of pyrene by pseudomonas sp. JPN2 and its initial degrading mechanism study by combining the catabolic nahAc gene and structure-based analyses[J]. Chemosphere, 2016, 164: 379-386.
目录 contents

    摘要

    为了构建能够稳定遗传且高效降解多环芳烃的工程菌,利用PCR技术对Pseudomonas songnenensis wp3-1的邻苯二酚-2, 3-双加氧酶(C23O)基因进行克隆,并将其与自杀性载体pUTmini-Tn5连接,得到重组载体pUTmini-Tn5-C23O。在三亲接合作用下,经mini-Tn5转座子将重组载体pUTmini-Tn5-C23O中的C23O基因整合到菌株Pseudomonas sp. wp4的染色体DNA中,最终得到基因工程菌wp4-C23O。在不同pH、温度下,菌株wp4和工程菌wp4-C23O对浓度为50 mg∙L-1的芘进行降解7 d。2株菌降解最适温度为37 ℃、最适pH为7.5。在此条件下,工程菌wp4-C23O对芘降解率显著高于wp4菌株(P<0.05),降解率提高11.45%。以PAHs降解优势菌株为受体构建工程菌可以去除石油污染土壤中的PAHs。

    Abstract

    This study aims to construct polycyclic aromatic hydrocarbons engineering bacteria with genetic stability and highly efficient degradation. Firstly, the catechol-2,3-dioxygenase (C23O) gene of Pseudomonas songnenensis wp3-1 was cloned by PCR technique, and was linked to suicide vector pUTmini-Tn5, then the recombinant vector pUTmini-Tn5-C23O was obtained. Secondly, the C230 gene of pUTmini-Tn5-C23O was integrated into the chromosomal DNA of Pseudomonas sp. wp4 with the triparental conjugation effect of mini-Tn5 transposition, and finally the gene engineering bacteria wp4-C23O was obtained. The result of contrast experiment to degrade pyrene solution (50 mg∙L-1) for 7 days indicated that the optimum environment conditions for strain wp4 and strain wp4-C23O were 37 ℃ and pH 7.5. Under these conditions, the engineering strain wp4-C23O showed significantly higher degradation rate of pyrene than wp4 strain (P<0.05), and it increased by 11.45%. The engineering bacteria taking PAHs degrading dominant strain as acceptor can effectively remove PAHs from petroleum-contaminated soil.

    赵亚光, 段魏魏, 徐苗, 等. 邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因在芘降解菌基因组的整合与表达 [J]. 环境工程学报, 2019, 13(1): 232-237.

    目前,土壤中的多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)治理主要是通过微生物降解。为了提高对PAHs的降解率,国内外学者一直尝试利用PCR等技术将微生物降解PAHs途径中的关键基因克隆到各种质粒中,使其在E.coli细胞内过量表达,从而达到高效降解PAHs目[1,2,3,4,5,6,7]。但质粒具有易丢失、遗传不稳定等缺点,而且基于E.coli构建出的PAHs降解工程菌对环境适应能力较差,难以直接用于去除土壤中的PAHs[8]。因此,利用基因工程菌高效处理PAHs必须保证其具有高效的降解力及种群优势。在影响基因工程菌稳定性的诸多因素中,宿主细胞的遗传特性、质粒的组成及所处的环境条件等3方面因素受到研究人员的广泛重[9]。NAGAYAMA[10]从石油降解菌中克隆出加氧酶基因,连接自杀性载体,通过三亲接合转化将加氧酶基因插入多环芳烃降解优势菌株Pseudomonas putida基因组上,构建出多环芳烃降解工程菌,该菌株对多环芳烃降解率显著增加,且具有较好的遗传稳定性。本研究利用PCR技术克隆出Pseudomonas songnenensis wp3-1的邻苯二酚-2,3-双加氧酶(catechol-2,3-dioxygenase)基因,与自杀性载体pUTmini-Tn5连接重组,形成pUTmini-Tn5-C23O重组质粒,经转化,构建出三亲接合作用的供体菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O,然后通过三亲接合转化将供体菌株重组质粒pUTmini-Tn5-C23O中的C23O基因转座到Pseudomonas sp.wp4基因组上,得到芘降解工程菌wp4-C23O,并且检验工菌株对芘的降解率。该方法不仅有效提高芘降解率,而且解决了遗传不稳定的问题。此外,以PAHs降解优势菌株Pseudomonas sp. wp4构建的工程菌对环境适应能力较强,可以应用于石油污染土壤中的PAHs处理。

  • 1 材料与方法

    1
  • 1.1 试剂、载体与菌株

    1.1

    芘购自Sigma 公司,纯度≥99%,二氯甲烷购自大连宝生物公司,为HPLC 级,所用酶购自Takara公司,其他化学试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。载体与菌株来源见表1

    表1 载体与菌株特性及来源

    Table 1 Vector and strain characteristics and sources

    菌株和质粒特性来源
    Escherichia coli S17-1(λpir)pUTmini-Tn5宿主菌BioVector,Inc.
    E.coli HB101(RK2013)三亲结合辅助菌,KmrBioVector,Inc.

    Pseudomonas songnenensis wp3-1

    (登录号:KX925840)

    C23O基因供体菌实验室保存

    Pseudomonas sp.wp4

    (登录号:KX925841)

    三亲结合受体菌,基因组DNA含C23O基因,

    无Kmr,StrRr

    实验室保存
    载体pUTmini-Tn5带有Tn5的自杀性质粒,Ampr,oriR6K,KmrBioVector,Inc.
    Escherichia coli S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O三亲结合供体菌本研究构建
  • 1.2 培养基

    1.2

    MS无机盐培养基:MgSO4 0.2 g;KH2PO4 1 g;NH4NO3 1 g;CaCl2 0.02 g;FeCl3·6H2O 微量;H2O 1 000 mL。LB 培养基:酵母膏5 g;蛋白胨10 g;氯化钠5 g;H2O 1 000 mL。

  • 1.3 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O构建与鉴定

    1.3

    Pseudomonas songnenensis wp3-1基因组为模板,正向引物5'-ATTTGCGGCCGCAGGTGWCGTSATGAAMAAAGG-3'和反向引物5'-ATTTGCGGCCGCTYAGGTSAKMACGGTCAKGAA-3'对C23O基因进行PCR扩增。每个引物含NotI酶切位点GCGGCCGC。PCR条件按文献中的方[11]进行。将PCR产物和自杀性载体pUTmini-Tn5分别在37 ℃条件下经NotI酶消化4 h,分别电泳,切胶回收。之后将回收的C23O基因和pUTmini-Tn5载体片段在16 ℃条件下经T4酶连过夜(构建过程如图1所示)。然后将连接液用热激转化到感受态细胞大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir)。用涂布棒将转化菌悬液涂布于包含邻苯二酚(100 mg∙L-1)、卡那霉素(50 mg∙L-1)以及链霉素(50 mg∙L-1)的LB固体培养基上。在37 ℃条件下培养过夜,然后挑取淡黄色菌落即为阳性克隆大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir) pUTmini-Tn5-C23O。将其扩大培养提取质粒,用C23O基因特异性引物进行PCR扩增,并测序检验目的基因存在,正向引物为5'-AGGTGWCGTSATGAAMA-AAGG-3'和反向引物为5'-TYAGGTSAKMACGGTCAKGAA-3',PCR条件按文献中的方[11]进行。

    图 1
                            重组载体pUTmini-Tn5-C23O构建过程

    图 1 重组载体pUTmini-Tn5-C23O构建过程

    Fig. 1 Construction process of recombinant vector pUTmini-Tn5-C23O

  • 1.4 三亲接合转化

    1.4

    按文献中的方[12],将供体菌S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O、辅助菌E .coli HB101(RK2013)、受体菌Pseudomonas sp. wp4在含有相应抗生素的LB液体培养基中培养8 h,然后将供体菌、辅助菌、受体菌按照3∶3∶2的比例混合后,30 ℃下10 000 r∙min-1离心3 min,收集菌体,用无菌生理盐水洗涤3次除去抗生素,加入200 µL LB液体培养基重悬,然后置于LB固体平板的细菌滤膜上。在30 ℃培养过夜,次日将菌体从平板上洗下,用1 mL生理盐水重悬混合液,然后稀释不同浓度,涂布于含有邻苯二酚100 mg∙L-1、卡那霉素50 mg∙L-1、以及链霉素50 mg∙L-1的LB选择性培养基平板上,筛选阳性克隆,并命名为wp4-C23O。

  • 1.5 工程菌鉴定

    1.5

    提取菌株wp4和工程菌基因组DNA,根据重组载体pUTmini-Tn5-C23O的km基因和C23O基因序列分别设计上游引物F:5'-GGCAGCGCAACGGAACATTCA-3'和下游引物R:5'-GACGAACCTGGTATGGATTT-3',进行PCR扩增,产物预期长度为1 900 bp左右,检验2株菌基因组是否同时含有km基因和C23O基因,以此确定C23O基因是否插入受体菌Pseudomonas stutzeri wp4。PCR 反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s,60 ℃ 60 s, 72 ℃ 90 s,30个循环;72 ℃ 7 min。

  • 1.6 菌悬液配制

    1.6

    将LB培养基中菌株wp-4和工程菌的对数期菌液于2 mL无菌离心管中,在4 ℃下,10 000 r∙min-1离心1 min,弃上清液,用无机盐培养基洗涤3次,再用无机盐培养基制成OD600= 0.1菌悬液备用。

  • 1.7 芘降解率单因素实验

    1.7

    温度对芘降解率的影响。将二氯甲烷配置的芘标准液加入到pH为7.0的50 mL 无机盐培养基中,使其最终浓度均为50 mg∙L-1。在34 ℃下,140 r∙min-1摇床振荡24 h,待二氯甲烷挥发完全,然后在培养基中加入500 μL菌株wp4和工程菌株菌悬液,分别在28、31、34、37和40 ℃温度条件下,140 r∙min-1摇床振荡培养7 d,分别测定菌株芘降解率,实验重复3次。

    pH对芘降解率的影响。将二氯甲烷配置的芘标准液加入pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的50 mL无机盐培养基中,使其最终浓度均为50 mg∙ L-1。在34 ℃下,140 r∙min-1摇床振荡24 h,待二氯甲烷挥发完全,然后在培养基中加入500 μL菌株wp4和工程菌株菌悬液,在37 ℃下,140 r∙min-1摇床振荡培养7 d,分别测定菌株芘降解率,实验重复3次。

    菌株芘降解率测定按文献中的方[13,14]进行,用紫外分光光度计测定242 nm波长下的吸光度值。芘标准曲线方程:y=0.172 72x+0.058 19(R2=0.999 32)。配制芘浓度为 50 mg∙L-1的无机盐液体培养基。将上述培养7 d的培养液,整瓶提取,用有机溶剂二氯甲烷振荡离心萃取 3 次,萃取液经无水硫酸钠过滤定容后,用紫外分光光度计分析。检测波长242 nm下吸光度值,根据标准曲线计算其降解率。

  • 1.8 数据处理

    1.8

    数据采用 Excel 2003 和 OriginLab OriginPro 8.6 进行处理和制图,运用SPSS 18.0 软件进行方差分析。

  • 2 结果与分析

    2
  • 2.1 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O的筛选

    2.1

    将从含有邻苯二酚100 mg∙L-1、卡那霉素50 mg∙L-1以及链霉素50 mg∙L-1的LB选择性培养基筛选出的阳性克隆重复划线,观察生长状况,结果如图2所示。菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O生长良好,且出现淡黄色。这表明菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O初步构建成功。

  • 2.2 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O的PCR鉴定

    2.2

    提取菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O的质粒作为模板,用C23O特异性引物进行PCR扩增,验证阳性克隆大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir) pUTmini-Tn5-C23O,结果如图3所示。PCR条带大小为900 bp左右,经测序与目的基因C23O序列一致,表明S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O构建成功。

    图 2
                            菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O筛选结果

    图 2 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O筛选结果

    Fig. 2 Screening results of strain S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O

  • 2.3 工程菌构建验证

    2.3

    将受体菌Pseudomonas stutzeri wp4、供体菌大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir) pUTmini-Tn5-C23O以及E .coli HB101(RK2013)进行三亲和转化,然后在选择培养基上筛选得到阳性克隆子,即工程菌wp4-C23O。用特异性引物对菌株wp4和工程菌DNA基因组进行PCR扩增km基因和C23O基因,结果如图4所示。菌株wp4基因组同时不含km基因和C23O基因,工程菌基因组同时含km基因和C23O基因,且PCR产物大小为1 900 bp左右,与预期大小一致。这表明C23O基因经过转座子Tn5共同插入到受体菌Pseudomonas stutzeri wp4 DNA基因组上。

  • 2.4 单因素实验

    2.4
  • 2.4.1 温度对芘降解率的影响

    2.4.1
    图3
                            pUTmini-Tn5-C23O构建过程的电泳验证

    图3 pUTmini-Tn5-C23O构建过程的电泳验证

    Fig. 3 Electrophoresis map of construction process of pUTmini-Tn5-C23O

    如图5所示,菌株wp4和工程菌wp4-C23O经过7 d培养,在一定范围内,随温度提高芘降解率增加,但在37 ℃以后,芘降解率下降,在37 ℃时,降解率达到最大。此温度下,菌株wp4和工程菌wp4-C23O芘降解率分别为71.75%、82.20%。在28、31、34、37和40 ℃时,工程菌比菌株wp4芘降解率有显著增加(P<0.05)。以上结果表明,在不同温度下,工程菌芘降解率显著高于菌株wp4(P<0.05),降解率提高10.45%。

  • 2.4.2 pH对芘降解率的影响

    2.4.2

    如图6所示,菌株wp4和工程菌wp4-C23O经过7 d培养,在一定pH内,随pH升高,芘降解率增加,pH大于7.5之后,2株菌株芘降解率减小,最适pH为7.5,在此pH下,菌株wp4和工程菌芘降解率分别为71.42%、82.87%。当pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0时,工程菌比菌株wp4芘降解率有显著增加(P<0.05)。在不同pH下,工程菌芘降解率显著高于菌株wp4(P<0.05),降解率提高11.45%。

    图 4
                            km基因和C23O基因PCR 检测结果

    图 4 km基因和C23O基因PCR 检测结果

    Fig. 4 PCR results of km and C23O gene

    目前,多数研究者通过选用合适的表达质粒将邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因与其连接,目的主要是提高该基因表达量。但是,质粒具有遗传不稳定的缺点,导致重组质粒可能丢失。而通过转座子将邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因插入到微生物基因组上,这在一定程度上提高了该基因遗传稳定性。谢[12]通过转座子将具有PAHs降解特性的恶臭假单胞菌中邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因插入到烷烃降解菌BS3的DNA组上,构建出工程菌,验证了该菌株具有较高的遗传稳定性。本研究选用从克拉玛依石油污染土壤分离出的菌株Pseudomonas sp.wp4作为受体菌,该菌株对石油污染土壤中的PAHs具有较好的降解性,且普遍存在,甚至可以形成优势菌株。运用菌株Pseudomonas sp.wp4构建出的工程菌wp4-C23O对芘降解率显著高于菌株Pseudomonas sp.wp4,且高于其他芘降解[15,16,17,18,19]。菌株wp4、工程菌的最适pH、温度分别为7.5、37 ℃,表明工程菌经过基因组整合后的基本生长特性没有变化。因而,可以去除石油污染土壤中的PAHs。

    图5
                            温度对芘降解率的影响

    图5 温度对芘降解率的影响

    Fig. 5 Effect of temperature on pyrene degradation rate

    图6
                            pH对芘降解率的影响

    图6 pH对芘降解率的影响

    Fig.6 Effect of pH on pyrene degradation rate

  • 3 结论

    3

    1)通过三亲接合转化将C23O基因插入到降解多环芳烃优势菌株wp4基因组上,成功构建降解了多环芳烃的工程菌wp4-C23O。该工程菌具有实际应用的潜力。

    2)选择pH、温度为影响因素,对浓度为50 mg∙L-1的芘无机盐培养基进行了菌株wp4和工程菌wp4-C23O降解实验,结果表明:2株菌最适降解pH为7.5、最适温度为37 ℃。在此条件下,工程菌wp4-C23O対芘降解率显著高于wp4菌株,降解率提高11.45%。

  • 参考文献

    • 1

      LEE J, MIN K R, KIM Y. Cloning and overexpression of methylcatechol-2, 3-dioxygenase gene from toluene-degrading Pseudomonas putida, mt-2 (pWWO)[J]. Archives of Pharmacal Research, 1992, 15(4): 360-364.

    • 2

      张杰, 刘永生, 冯家勋, 等. 邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因克隆、定位和高效表达[J]. 应用与环境生物学报, 2003, 9(5):542-545.

    • 3

      胡日查, 孙立波. 低温-1,2,4-TCB降解菌的选育、降解特性及邻苯二酚-1,2-双加氧酶基因表达水平[J]. 环境工程学报, 2013, 7 (2): 777-782.

    • 4

      BALDERAS-HERNANDEZ V E, TREVINO-QUINTANILLA L G, HERNANDEZ-CHAVEZ G, et al. Catechol biosynthesis from glucose in Escherichia coli anthranilate-overproducer strains by heterologous expression of anthranilate-1,2-dioxygenase from Pseudomonas aeruginosa PAO1[J]. Microbial Cell Factories, 2014, 13(1): 1-11.

    • 5

      ARAUJO S S, NEVES C M, GUIMARAES S L, et al. Structural and kinetic characterization of recombinant 2-hydroxymuconate semialdehyde dehydrogenase from Pseudomonas putida G7[J]. Archives of Biochemistry & Biophysics, 2015, 579(1):8-17.

    • 6

      LIN J, MILASE R N. Purification and characterization of catechol-1,2-dioxygenase from Acinetobacter sp. Y64 strain and Escherichia coli transformants[J]. Protein Journal, 2015, 34(6): 1-13.

    • 7

      LEE N, KWON D Y.Characteristics of a recombinant-2,3-dihydroxybiphenyl-1,2-dioxygenase from Comamonas sp. expressed in Escherichia coli[J]. Indian Journal of Microbiology, 2016, 56(4): 1-9.

    • 8

      杜宏伟, 武俊, 肖琳, 等. 聚磷激酶基因在假单胞菌中的整合和表达[J]. 环境科学, 2009, 30(10): 3011-3015.

    • 9

      蔡丰聚, 徐英黔. 基因工程菌稳定性的若干影响因素[J]. 生命的化学, 2006, 26(5): 451-453.

    • 10

      NAGAYAMA H, SUGAWARA T, ENDO R, et al. Isolation of oxygenase genes for indigo-forming activity from an artificially polluted soil metagenome by functional screening using Pseudomonas putida strains as hosts[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(10): 4453-4470.

    • 11

      陈志丹, 晁群芳, 杨滨银, 等. 一株芘降解菌B2的降解条件优化及降解基因[J]. 环境工程学报, 2012, 6(10): 3795-3800.

    • 12

      谢云. 高效石油烷烃降解菌及原油降解基因工程菌构建研究[D]. 西安: 西北大学, 2014.

    • 13

      聂麦茜, 张志杰, 雷萍. 优势短杆菌对多环芳烃的降解性能[J]. 环境科学, 2001, 22(6): 83-85.

    • 14

      杨轩, 张威, 李师翁, 等. 多环芳烃降解菌的分离鉴定及其生理特性研究[J]. 环境科学学报, 2012, 32(5): 1033-1040.

    • 15

      卫昆, 陈烁娜, 尹华, 等. 蜡状芽胞杆菌对芘的降解特性及降解酶研究[J]. 环境科学学报, 2016, 36(2): 506-512.

    • 16

      胡凤钗, 苏振成, 孙健, 等. 高效芘降解菌N12的分离鉴定与降解特性[J]. 应用生态学报, 2011, 22(6):1566-1572.

    • 17

      HU F C, LI X Y, SU Z C, et al. Identification and degradation capability of three pyrene-degrading Gordonia sp.strains [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2011, 22(7): 1857-1862.

    • 18

      AL-THUKAIR A A, MALIK K. Pyrene metabolism by the novel bacterial strains Burkholderia fungorum (T3A13001) and Caulobacter sp (T2A12002) isolated from an oil-polluted site in the Arabian Gulf[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2016, 110: 32-37.

    • 19

      JIN J, YAO J, ZHANG Q, et al. Biodegradation of pyrene by pseudomonas sp. JPN2 and its initial degrading mechanism study by combining the catabolic nahAc gene and structure-based analyses[J]. Chemosphere, 2016, 164: 379-386.

赵亚光

机 构:新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐 830046

Affiliation:College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China

角 色:第一作者

Role:First author

邮 箱:1292782688@qq.com

第一作者简介:赵亚光(1991— ),男,硕士研究生。研究方向:环境与资源微生物。E-mail:1292782688@qq.com

段魏魏

机 构:新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐 830046

Affiliation:College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China

徐苗

机 构:新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐 830046

Affiliation:College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China

吴盼云

机 构:新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐 830046

Affiliation:College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China

肖璐梅

机 构:新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐 830046

Affiliation:College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China

马腾飞

机 构:新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐 830046

Affiliation:College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China

晁群芳

机 构:新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐 830046

Affiliation:College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China

角 色:通讯作者

Role:Corresponding author

邮 箱:xjchqf@sina.comxjchqf@sina.com

作者简介:晁群芳(1967— ),女,硕士,副教授。研究方向:环境与资源微生物。E-mail:xjchqf@sina.com

金曙光,郑晓梅,张利田

角 色:中文编辑

Role:Editor

菌株和质粒特性来源
Escherichia coli S17-1(λpir)pUTmini-Tn5宿主菌BioVector,Inc.
E.coli HB101(RK2013)三亲结合辅助菌,KmrBioVector,Inc.

Pseudomonas songnenensis wp3-1

(登录号:KX925840)

C23O基因供体菌实验室保存

Pseudomonas sp.wp4

(登录号:KX925841)

三亲结合受体菌,基因组DNA含C23O基因,

无Kmr,StrRr

实验室保存
载体pUTmini-Tn5带有Tn5的自杀性质粒,Ampr,oriR6K,KmrBioVector,Inc.
Escherichia coli S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O三亲结合供体菌本研究构建
/html/teepc_cn/201807117/alternativeImage/ec1fa700-768b-411b-bf10-cfabcd00eb71-F001.jpg
/html/teepc_cn/201807117/alternativeImage/ec1fa700-768b-411b-bf10-cfabcd00eb71-F002.jpg
/html/teepc_cn/201807117/alternativeImage/ec1fa700-768b-411b-bf10-cfabcd00eb71-F003.jpg
/html/teepc_cn/201807117/alternativeImage/ec1fa700-768b-411b-bf10-cfabcd00eb71-F004.jpg
/html/teepc_cn/201807117/alternativeImage/ec1fa700-768b-411b-bf10-cfabcd00eb71-F006.jpg
/html/teepc_cn/201807117/alternativeImage/ec1fa700-768b-411b-bf10-cfabcd00eb71-F005.jpg

表1 载体与菌株特性及来源

Table 1 Vector and strain characteristics and sources

图 1 重组载体pUTmini-Tn5-C23O构建过程

Fig. 1 Construction process of recombinant vector pUTmini-Tn5-C23O

图 2 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O筛选结果

Fig. 2 Screening results of strain S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O

图3 pUTmini-Tn5-C23O构建过程的电泳验证

Fig. 3 Electrophoresis map of construction process of pUTmini-Tn5-C23O

图 4 km基因和C23O基因PCR 检测结果

Fig. 4 PCR results of km and C23O gene

图5 温度对芘降解率的影响

Fig. 5 Effect of temperature on pyrene degradation rate

图6 pH对芘降解率的影响

Fig.6 Effect of pH on pyrene degradation rate

image /

无注解

无注解

无注解

无注解

无注解

无注解

无注解

  • 参考文献

    • 1

      LEE J, MIN K R, KIM Y. Cloning and overexpression of methylcatechol-2, 3-dioxygenase gene from toluene-degrading Pseudomonas putida, mt-2 (pWWO)[J]. Archives of Pharmacal Research, 1992, 15(4): 360-364.

    • 2

      张杰, 刘永生, 冯家勋, 等. 邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因克隆、定位和高效表达[J]. 应用与环境生物学报, 2003, 9(5):542-545.

    • 3

      胡日查, 孙立波. 低温-1,2,4-TCB降解菌的选育、降解特性及邻苯二酚-1,2-双加氧酶基因表达水平[J]. 环境工程学报, 2013, 7 (2): 777-782.

    • 4

      BALDERAS-HERNANDEZ V E, TREVINO-QUINTANILLA L G, HERNANDEZ-CHAVEZ G, et al. Catechol biosynthesis from glucose in Escherichia coli anthranilate-overproducer strains by heterologous expression of anthranilate-1,2-dioxygenase from Pseudomonas aeruginosa PAO1[J]. Microbial Cell Factories, 2014, 13(1): 1-11.

    • 5

      ARAUJO S S, NEVES C M, GUIMARAES S L, et al. Structural and kinetic characterization of recombinant 2-hydroxymuconate semialdehyde dehydrogenase from Pseudomonas putida G7[J]. Archives of Biochemistry & Biophysics, 2015, 579(1):8-17.

    • 6

      LIN J, MILASE R N. Purification and characterization of catechol-1,2-dioxygenase from Acinetobacter sp. Y64 strain and Escherichia coli transformants[J]. Protein Journal, 2015, 34(6): 1-13.

    • 7

      LEE N, KWON D Y.Characteristics of a recombinant-2,3-dihydroxybiphenyl-1,2-dioxygenase from Comamonas sp. expressed in Escherichia coli[J]. Indian Journal of Microbiology, 2016, 56(4): 1-9.

    • 8

      杜宏伟, 武俊, 肖琳, 等. 聚磷激酶基因在假单胞菌中的整合和表达[J]. 环境科学, 2009, 30(10): 3011-3015.

    • 9

      蔡丰聚, 徐英黔. 基因工程菌稳定性的若干影响因素[J]. 生命的化学, 2006, 26(5): 451-453.

    • 10

      NAGAYAMA H, SUGAWARA T, ENDO R, et al. Isolation of oxygenase genes for indigo-forming activity from an artificially polluted soil metagenome by functional screening using Pseudomonas putida strains as hosts[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(10): 4453-4470.

    • 11

      陈志丹, 晁群芳, 杨滨银, 等. 一株芘降解菌B2的降解条件优化及降解基因[J]. 环境工程学报, 2012, 6(10): 3795-3800.

    • 12

      谢云. 高效石油烷烃降解菌及原油降解基因工程菌构建研究[D]. 西安: 西北大学, 2014.

    • 13

      聂麦茜, 张志杰, 雷萍. 优势短杆菌对多环芳烃的降解性能[J]. 环境科学, 2001, 22(6): 83-85.

    • 14

      杨轩, 张威, 李师翁, 等. 多环芳烃降解菌的分离鉴定及其生理特性研究[J]. 环境科学学报, 2012, 32(5): 1033-1040.

    • 15

      卫昆, 陈烁娜, 尹华, 等. 蜡状芽胞杆菌对芘的降解特性及降解酶研究[J]. 环境科学学报, 2016, 36(2): 506-512.

    • 16

      胡凤钗, 苏振成, 孙健, 等. 高效芘降解菌N12的分离鉴定与降解特性[J]. 应用生态学报, 2011, 22(6):1566-1572.

    • 17

      HU F C, LI X Y, SU Z C, et al. Identification and degradation capability of three pyrene-degrading Gordonia sp.strains [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2011, 22(7): 1857-1862.

    • 18

      AL-THUKAIR A A, MALIK K. Pyrene metabolism by the novel bacterial strains Burkholderia fungorum (T3A13001) and Caulobacter sp (T2A12002) isolated from an oil-polluted site in the Arabian Gulf[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2016, 110: 32-37.

    • 19

      JIN J, YAO J, ZHANG Q, et al. Biodegradation of pyrene by pseudomonas sp. JPN2 and its initial degrading mechanism study by combining the catabolic nahAc gene and structure-based analyses[J]. Chemosphere, 2016, 164: 379-386.